Genetyczne przyczyny wad nerek w zespole DiGeorge ad 5

Panel C pokazuje zarodki, które zostały wstrzyknięte CRISPR-Cas9 i które odtwarzają defekty splotu obserwowane w zarodkach morfologicznych. Przewodnik RNA (gRNA), który był skierowany do każdego odpowiedniego genu, został poddany mediacji z oczyszczonym białkiem Cas9, a względna długość pronephros została zmierzona u założycieli, jak pokazano w panelu D. W panelach B i D pojedyncza gwiazdka oznacza P <0,05, dwie gwiazdki P <0,01 i trzy gwiazdki P <0,001. WT oznacza typ dziki. Najpierw staraliśmy się ustalić fenotypowy odpowiednik wrodzonych wad nerek i dróg moczowych w zarodkach danio pręgowanego. Wcześniejsze badania na myszach i ludziach wykazały kluczową rolę genu kodującego protoonkogen (RET) dla rozwoju nerek i morfogenezy rozgałęziania.32-35 Dlatego wstrzyknęliśmy ustalony oligonukleotyd morfolinowy (MO) przeciwko RET36 do danio pręgowanego, który został zmodyfikowany do umożliwić wizualizację rozwijającego się nefronu, a następnie zbadać splot wyrostka robaczkowego (najwcześniejszy stadium rozwojowe u danio pręgowanego) w 4,5 dni po zapłodnieniu. 37 Wstrzyknięcie 8,0 ng mO blokującego splot, który tłumił około 80% wpisz wiadomość i zainicjuj włączenie intronu 2, a następnie barwienie zarodków przeciwciałem przeciwko ATPazie potasowo-sodowej, wywołane defekty splotu proksymalnych pronephros i ogólne zmniejszenie długości kanalików (ryc. S3 w Dodatku uzupełniającym) . Uchwyciliśmy ten fenotyp mierząc długość kanalika skorygowanego o całkowitą długość zarodkowej osi ciała, kontrolując w ten sposób możliwe opóźnienie rozwoju spowodowane mechaniczną manipulacją zarodkami (P <0,05 dla wszystkich porównań między knockdownem MO a typem dzikim) ( Figura 2A i 2B). Ten fenotyp był swoisty; nie tylko byliśmy w stanie uratować tę anomalię przez jednoczesne wyodrębnienie 200 .g matrycowego mRNA RNA (mRNA) z zakorkowanym czapeczką ludzką (Figura 2B), ale delecje w tym locus, w którym pośredniczy CRISPR-Cas9, również odtwarzały tę anomalię w sposób nie do odróżnienia od MO, zarówno jakościowo, jak i ilościowo (ryc. 2C i 2D). W związku z tym przystąpiliśmy do wdrożenia tego testu we wszystkich testowalnych genach w regionie o zmienności liczby kopii.
Najpierw użyliśmy algorytmu Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) do wyszukiwania sekwencji, w którym wykryliśmy ortologi dla siedmiu z dziewięciu genów. Dane z sekwencjonowania RNA wskazywały, że wszystkie siedem genów ulegało ekspresji we wczesnym zarodku, w okresie od 2 do 4 dni po zapłodnieniu38. Dlatego zaprojektowaliśmy MO, aby znokautować ekspresję tych genów i wstrzyknąć je do linii reporterskich danio pręgowanego równolegle z ret-MO jako kontrola. W przypadku czterech transkryptów (lztrl, pi4ka, serpind1 i slc7a4) nie stwierdziliśmy różnic w złożoności splotu lub długości pronephros między dankiem knockdown a kontrolami w 26 do 34 zarodków, przy czym każda analiza powtórzona dwukrotnie z zaślepionym oceną (ryc. W przeciwieństwie do tego supresja ekspresji chrisa lub przerwanie składania aifm3 i snap29 fenokopią patologiczne cechy RET (Figura 2A i 2B). Te fenotypy można by uratować dla każdego z trzech genów za pomocą coinkopcji z ludzkim mRNA (Figura 2B)
[przypisy: stomatolog piaseczno, dentysta olsztyn, naklejka na legitymację ]